荧光显微镜在研究生物结构和功能方面发挥着重要作用。然而由于光学衍射的限制，传统荧光显微镜的空间分辨率限制在激发波长的一半（约200纳米），阻碍了其在许多重要的细胞内生理过程的观察。目前，受激辐射损耗（STED）超分辨率纳米技术的出现打破了Abbe衍射势垒，提供了超越衍射极限的光学分辨率，为亚细胞尺寸的生命活动的探索提供了强大的技术支持。在STED显微镜中，激发光使荧光分子从暗态的基态激发到亮态的激发态而产生了自发辐射。随后甜甜圈型的STED光使处于激发态的激发点边缘的荧分子通过受激辐射的方式回落到基态，从而提高分辨率。传统的STED探针为了避免STED光对探针再激发和检测窗口的选择，通常STED光波长选择处于探针发射波长的红波拖尾处，因此需要的STED光的功率较高，但不可避免的会对生物样品造成损伤和探针的光漂白。因此发展低功率的STED探针是一种迫切的需求。

为了解决这一问题，首都师范大学/天津大学付红兵团队（满忠伟、吕铮博士），北京大学基础医学院郑乐民团队（崔宏图博士）和北京大学未来技术学院席鹏团队（吴朝阳博士）在Nano Letters上发表论文Organic Nanoparticles-Assisted Low-Power STED Nanoscopy，提出了在荧光探针最大发射波长处进行损耗的策略，该策略大幅降低了STED光强的需求，并成功在低功率下观察到了溶酶体的融合与裂解过程，为亚细胞尺寸生物过程的研究提供了平台。

本文中，研究团队设计合成了一种具有高固态亮度的有机分子TPACN，通过Stober方法在纳米颗粒表面包裹上一层二氧化硅壳层，该纳米颗粒表面光滑、尺寸均匀、亮度高，稳定性高，Stokes位移大，同时，通过飞秒瞬态吸收证明了纳米颗粒高的受激辐射的存在，因此该探针非常有利于STED超分辨成像（图一）。

图一

随后，研究者考察了TPACN纳米颗粒的STED成像效果。研究者发现探针不仅可以被拖尾处的775纳米STED光可以进行损耗，同时最大发射波长处也能使用660纳米STED光进行损耗。得益于最大波长处高的受激辐射截面，饱和值比文献中报道的最小值降低了一个数量级，比商用的STED探针降低了2-3个数量级。同时，研究者仔细比较了不同位置进行损耗的区别（图二），可以看出，在同样的分辨率情况下，使用660纳米的STED光强度比775纳米的STED光强度降低了约60倍。通过该策略可以有效的降低STED光功率，为长时间细胞内动态成像提供了可能。

图二

为了进一步考察TPACN纳米颗粒的应用前景，研究者考察了细胞内溶酶体的动态运动过程。TPACN纳米颗粒具有很高的溶酶体靶向能力，优异的光学为稳定性，低的功率需求，细胞内溶酶体的kiss and run过程和融合与裂解过程被高分辨的记录下来，分辨率达到34纳米。值得注意的是，TPACN纳米颗粒表面带有丰富的氨基结构，为偶联不同的抗体实现所需的区域成像提供了无限的可能。

图三

综上所述，该工作中，本研究团队发展了一种小尺寸、高亮度、高稳定性、受激辐射效率高的荧光探针。利用大Stokes位移实现最大发射波长处进行损耗的策略，大大降低了激光功率的需求，为发展低功率STED探针提供了新思路。同时，纳米颗粒高的溶酶体靶向能力为细胞内溶酶体动态过程观察提供了前提，低的功率需求为溶酶体长时间的动态成像提供了可能，有趣的是TPACN纳米颗粒表面的氨基结构为生物偶联做出了铺垫，其更广阔的应用有望得到继续开发。

首都师范大学/天津大学博士满忠伟、吕铮，北京大学基础医学院崔宏图，北京大学未来技术学院吴朝阳为本篇论文的第一作者；首都师范大学/天津大学付红兵教授、徐珍珍教授，北京大学基础医学院郑乐民教授，北京大学未来技术学院席鹏教授为共同通讯作者。

近年来，付红兵团队与郑乐民团队在超分辨成像领域取得了一系列的进展，探针被应用于活细胞中溶酶体和线粒体的动态超分辨成像当中，并有望取代市售溶酶体和线粒体靶向探针，相关研究成果发表在Nanoscale（2019年），Advanced Functional Materials（2020年）。两个团队还致力于对动脉粥样硬化斑块的识别，从细胞水平的识别（Advanced Functional Materials, 2017; ACS APPL MATER INTERFACES, 2017），到应用光声成像技术对体内不稳定斑块进行靶向识别Advanced Materials（2020年）。

原文链接：

https://pubs.acs.org/doi/full/10.1021/acs.nanolett.1c00161